基于生物发光技术的细菌总数快速检测仪

　　岳伟伟，周爱玉，何保山，罗金平，蔡新霞

　　(1．中国科学院电子学研究所 传感技术国家重点实验室，北京 100080；2．中国科学院研究生院，北京 100080)

　　1 引言

　　细菌总数检测是食品卫生学检测领域的重要检测指标，主要是用来判断食品被污染的程度。对细菌总数进行快速准确的检测一直是该领域内重要的研究课题。对细菌总数进行检测的国标方法是平板计数法，需要将样品用营养琼脂37℃培养48 h记数，测试时间长，操作繁琐，不适合现场检测。ATP生物发光检测方法具有检测速度快、成本低、易于操作等特点，已引起众多研究者关注。同时，因为ATP生物发光技术以生物体内的ATP作为检测对象，不仅包括细菌，也包括体细胞在内的食品残渣等食品污染物，因此适合在食品卫生检测领域对卫生状况进行快速检测。

　　使用ATP生物发光技术测量ATP最早见于1949年Mcelroy的报道。自此以后，ATP生物发光技术引起广泛关注。本文在分析前人工作的基础上，设计了一种ATP生物发光检测仪，选择光电倍增管(H5773-02，日本，滨松光子)作为光电转换器件，其峰值响应波长为500 nm，与反应所发荧光波长基本一致，从而提高检测灵敏度。本检测仪采用自动加样技术，在加入被检测样品后，在反应腔内由自动加样装置向检测样品池中自动加入反应试剂，从而既避免了外界光的干扰，也有效地提高了加样精度，从而提高了仪表的检测可靠性及准确性。利用本检测仪对10-6～10-14mol／L标准ATP样品进行了检测，输出信号与样品浓度间的相关性达到0.986，可以满足测量要求。

　　2 系统设计

　　2.1 检测原理

　　ATP即三磷酸腺苷，是广泛存在于生物体内的一种能量物质。实验证明，在生理条件下，每个细菌细胞中所含ATP的含量大致相同，约为10-18mol／个。萤火虫荧光素酶简称虫光素酶，是一种能将化学能转变为光能的活性蛋白质，即生物催化剂。ATP在虫光素酶的催化作用下，与荧光素在有氧环境及二价镁离子作用下，反应释放出荧光。当荧光素及虫光素酶过量情况下，释放的荧光与ATP在一定范围内成线性关系，因此可以通过测量荧光光强检测样品中的ATP，进而检测其中的细菌总数。

　　2.2 结构设计

　　本检测仪的结构如图1所示，主要包括三部分，分别为自动进样单元、光电转换单元和信号采集处理及控制单元。其中，自动进样单元包括三套蠕动泵(WX10，保定兰格恒流泵有限公司)和试剂盒，分为独立三路加样通路，分别为体细胞裂解剂、细菌细胞裂解剂和荧光素一荧光素酶发光试剂。根据测试需要，蠕动泵在控制单元控制下，向光电转换单元中的样品池加入对应反应试剂。光电转换单元包括检测样品池和光电转换器件。为消除外界光的干扰，整个光电转换单元被密封在暗盒中。光电转换器件将反应释放荧光转化为电信号，由信号采集处理单元采集并处理，并对测试结果进行实时显示和存储。

　　2.3 电路设计

　　系统的电路结构如图2所示。光电转换器件将荧光信号转换为电流信号，通过微处理芯片ADuC834(Analog Devices，美国)对信号进行采集及处理。ADuC834同时作为控制核心，控制自动加样单元，显示及存储单元，并可将测量结果通过RS232接口上传至上位机以进行结果分析。

　　2.4 软件设计

　　检测仪表的操作软件由C语言编写，软件结构如图3所示，共分三项功能模块，分别为测量、记录和仪表设置。其中，测量分为仪表独立测量和连接电脑测量。仪表独立测量时，微处理芯片ADuC834对一定时间内的信号采集并进行积分处理，然后将测试结果实时显示，根据用户选择也可将测试结果上传至计算机；联机测量时，ADuC834对所采集的信号不进行处理，而是直接将其传送到上位计算机中，并实时显示时间响应曲线，方便用户在计算机对所测数据进行分析，适合于实验室中的测试分析。记录子菜单分为记录查询和记录删除，用以对记录进行操作。采用24LC256作为外部数据存储芯片，本仪表设计可存储测试结果200条，记录查询时可对逐条记录进行显示；记录删除则分为逐条删除和全部删除；设置子菜单可实现仪表校准和倍增管电压调整两项功能。

　　3 实验与结果

　　3.1 器件选取

　　由于ATP生物发光所发光强较弱，因此本检测仪选用高灵敏的光电倍增管作为光电转换器件。利用F-4500荧光分光光度计(日本，日立)对ATP生物发光反应所发荧光波长进行扫描，峰值波长约为550 nm。为保证检测具有更高灵敏度，所选光电倍增管的响应波长应与荧光波长一致。日本滨松光子的H5773-02型光电倍增管的响应波长为330～850 nm，峰值检测波长在500～600 nm基本保持恒定，因此符合本系统设计要求。

　　3.2 结果与讨论

　　实验选择标准ATP样品作为检测对象，浓度范围为10-6～10-14mol／L，实验中所用荧光素及荧光素酶购自美国普洛麦格公司。实验采用联机测量方式，将本检测仪与计算机通过。RS232接口相连接，仪表信号采集单元采集荧光信号后直接上传至计算机并将测试结果实时显示。测量结果如图4所示。

　　在反应中，加入发光反应试剂时，体系中样品浓度相对较高，因此在短时间内即迅速反应释放大量荧光，此时荧光光强较强，因此测量结果可能会超出系统的测试量程。由于本仪表的最大输出电压为2500 mV，反应初期释放的荧光可能会超出该范围，在图中表现为前端的水平直线。随着反应进行，体系中样品和试剂的浓度逐渐降低，所释放荧光随之逐渐衰减。由图可见，不同样品浓度的ATP随反应进行，进入测量量程的时间不同，浓度越高，衰减越慢，进入测量量程的时间越长，反之越短。对图4中各响应曲线400 s内的测量值进行积分，作为各浓度样品的输出信号。输出信号与浓度的关系如图5所示。由图可以看出，输出信号随浓度增加而增加，且有明显梯度，两者的线性相关系数达到0.986。这一结果说明本检测系统可以对ATP浓度进行快速检测。由于细菌细胞中所含ATP含量基本一致，因此，本检测仪可实现对细菌总数的现场快速检测。

　　4 结 论

　　本文针对细菌总数检测需求，设计了一种基于ATP生物发光技术的细菌总数快速检测仪。该检测仪在对现有产品进行分析的基础上，选择H5773-02光电倍增管作为光电转换器件，其检测波长与生物发光反应所释放荧光波长一致，可有效提高检测灵敏度。采用自动加样技术，在暗室内加入发光反应试剂，消除了外界光的干扰，且获得了反应最初的信号。本文以细菌检测的中间产物标准ATP溶液作为检测对象，对所设计的检测仪进行测试。将检测仪与计算机连接测量，获得了各反应所释放荧光强度的时间响应曲线。在此基础上，对响应曲线400 s内的值进行积分，作为对应样品浓度的输出信号，得到了输出电压与浓度的关系曲线，两者的线性相关系数达到0.986，可满足测试要求。本文所设计的针对细菌总数的检测仪具有检测速度快、自动化程度高、操作简单、小型便携等特点，在口岸、卫生监管部门、食品生产部门等对产品、环境等的卫生状况进行现场快速检测领域具有很好的应用前景。