表面等离子共振型免疫传感器

RSD检测原理
表面等离子共振( surface p lasmon resonance, SPR)型免疫传感器,是利用SPR技术作为检测免疫分子间反应的一种光学免疫传感器。表面等离子体共振发生在介电常数不同的两个介质界面上,是入射光的电磁波和金属表面的自由电子形成的电荷密度波相互作用所产生的一种电荷密度振动。这种沿着金属表面传播的电荷密度波被称为表面等离子体波( SPW) ,它在金属内部的振幅是随着与表面垂直方向呈指数衰减 。根据Mexwell方程,可以得到SPW的波矢Ksp :

式中εm 是金属的介电常数,εa 是被测物的介电常数,ω为入射光的角频率, c为入射光在真空中的波
速。当水平偏振的入射光通过一个棱镜照射到金属表面时,入射光波矢在X轴上的投影Kx :

εp为棱镜介电常数,θ为入射角。如果入射光波矢在X 轴上的投影Kx 等于SPW的波矢Ksp ,入射光就
会在金属表面引起表面等离子体共振。入射光的大部分能量被SPW吸收后转化为热量,使反射光能量
急剧下降,可在反射光谱上出现反射强度最低值(即共振峰) 。如果与金属表面接触介质的折射率或被
测物介电常数发生变化,共振峰的位置(共振角或共振波长)将发生改变,因此通过测定共振角或共振
波长变化,就可获得被测物在界面上发生反应的信息 。在该原理基础上,通过在等离子共振装置反
应界面上修饰一层抗体分子,当抗原抗体识别后,共振峰的位置会发生位移,该位移的大小将反映固定
在金属表面的生物分子的量,进而实现免疫分析。

免疫传感器的构建

早在1982年Nylander等[ 9 ]就预言,基于SPR技术的生物传感器将是最具商业化潜力的一类传感
器。近年来,各种商品化的SPR型免疫传感器在免疫传感器的应用领域中已经成为最活跃的一个分
支。SPR型免疫传感器主要包括光波导器件、金属薄膜和生物敏感膜3部分。生物敏感膜的构建是决
定免疫分析的关键。在金属表面构建生物敏感膜一般有直接吸附和共价连接2种方式。

2. 2. 1　金属膜对免疫分子直接吸附　该方式最早被用于SPR型免疫传感器生物膜的构建[ 10 ] ,其缺点在于:

(1)免疫分子无法在金属表面形成稳定的生物敏感膜,致使其在金属表面覆盖率较低;

(2)固定在金属表面的免疫分子由于空间位阻效应可能损失部分活性;

(3)直接吸附法构建的生物敏感膜存在较大的非特异性吸附。

2. 2. 2　共价连接法　Morgan等[ 11 ]利用生物素和抗生物素蛋白链菌素能特异性结合的特点,利用共价结合方式构建了免疫传感器。首先在金属表面覆盖一层生物素,然后固定一层抗生物素蛋白链菌素,再将免疫分子固定在抗生物素蛋白链菌素层上。通过这种方法构建的生物敏感膜可降低金属表面的非特异性吸附,大大提高分析的特异性和准确性。也可采用葡聚糖法固定免疫分子,在镀金薄膜上通过烷基
巯醇形成亲水的自组装单层膜,然后通过环氧氯丙烷将羧甲基葡聚糖共价结合到巯醇自组装层上,用碘
乙酸处理葡聚糖使之产生羧基,之后用N2羟基硫代琥珀酰亚胺和12乙基232(32二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基,使活化的羧基与免疫分子的功能基团(如氨基)结合而达到固定免疫分子的目的[ 12 ] 。比较而言,羧甲基葡聚糖共价结合法在商品化SPR型免疫传感器制备中应用率最高。原因在于,有序自组
装层能阻碍生物分子与金属表面的直接接触,降低非特异性吸附,同时可通过自组装层功能基团进一步
衍生化,人工设计构建生物膜结构, 提高传感器识别能力。